Tobey Maguire (VF : Damien Witecka et VQ : Hugolin Chevrette) : Peter Parker/Spider-Man
* Kirsten Dunst (VF : Marie-Eugénie Maréchal et VQ : Aline Pinsonneault) : Mary-Jane Watson
* Alfred Molina (VF : Gabriel Ledoze et VQ : Luis De Cespedes) : Otto Octavius / Docteur Octopus
* James Franco (VF : Philippe Valmont et VQ : Antoine Durand) : Harry Osborn
* Rosemary Harris (VF : Monique Martial et VQ : Françoise Faucher) : May Parker
* Willem Dafoe (VF : Éric Herson-Macarel et VQ : Guy Nadon) : Norman Osborn
* J. K. Simmons (VF : Jean Barney et VQ : Pierre Chagnon) : J. Jonah Jameson
* Daniel Gillies (VF : Fabrice Josso) : John Jameson
* Donna Murphy (VF : Anne Jolivet) : Rosalie Octavius
* Dylan Baker (VQ : Pierre Auger) : Dr Curt Connors
* Bill Nunn (VF : Luc Florian) : Joseph « Robbie » Robertson
* Ted Raimi (VF : Alexandre Gillet) : Hoffman
* Elizabeth Banks (VF : Odile Cohen et VQ : Nathalie Hamel-Roy) : Miss Brant
* Cliff Robertson (VF : Marc Cassot et VQ : Denis Mercier) : Ben Parker
* Bruce Campbell (VF : Jean-Claude Donda) : Portier du théâtre
* Stan Lee (VF : Robert Planchet) : Vieil homme sauvant une femme dans la rue.
* Emily Deschanel : Réceptionniste mal aimable.
* Elia Baskin (VF : Alexandre Arbat) : Mr Ditkovitch
* Mageina Tovah (VF : Dinara Drukarova) : Ursula
* Joel McHale (VF : Marc Saez) : Mr Jacks
Thomas Jane : Frank Castle/Punisher (caméo)

* On peut voir l'apparition très rapide de Stan Lee, le créateur des comics lors du pillage d'une banque par le Docteur Octopus : il est un vieil homme sauvant une passante d'un bloc de roche lui tombant dessus.

* Bruce Campbell, le héros de la trilogie Evil Dead également réalisée par Sam Raimi, joue le rôle du portier du théâtre.
* On peut supposer aussi un clin d'oeil à Evil Dead lors de la scène de l'opération du Dr Octopus où l'un des chirurgiens brandi une tronçonneuse.

* Tobey Maguire a failli ne pas rempiler pour le rôle de Peter Parker à cause de ses problèmes de dos. S'il avait dû se retirer, l'acteur Jake Gyllenhaal était pressenti pour reprendre le flambeau. À noter que Sam Raimi se moque gentiment des problèmes de dos de l'acteur lors de la scène où Peter saute du toit d'un immeuble ("I'm back!" (VO) signifiant "Je suis de retour !" ; "Ça va faire mal !" (VF)) et tombe ("Ooooh, my back..." (VO) signifiant "Oooh mon dos..." ; "Ça fait mal..." (VF)).

* On notera un petit caméo de Thomas Jane alias Punisher au moment où Kirsten Dunst sort de l'église en courant.